Dr inż. Ryszard Gilewski
Prof. dr hab. Stanisław Wężyk

11.10.2019 r., to nie tylko obchodzony w Polsce od 2009 r. „Dzień Wychodzenia z Szafy” i uchwalony w 2011 r. przez Zgromadzenie Ogólne ONZ – „Międzynarodowy Dzień Dziewczynek”, lecz także „Światowy Dzień Jaja”, obchodzony od 1966 r., z inicjatywy Międzynarodowej Komisji ds. Jaj, zawsze w drugi piątek października. Jaja ptasie, podbierane przez naszych pra-pra-przodków z gniazd dzikich ptaków, służyły im od wielu tysięcy lat, jako źródło białka zwierzęcego.

Selekcjonując kury nieśne, uzyskano wysoko produkcyjne mieszańce towarowe, wyróżniające się wieloma cechami związanymi z nieśnością, a szczególnie z jej wytrwałością. Przedłużony okres nieśności wiąże się jednak z pogorszeniem jakości jaj. Zmiany w postępowaniu z nioskami, wymagają zwrócenia większej uwagi na ich fizjologię, metody żywienia i chowu, by wykorzystać ulepszone genotypy kur. Dodatkowe wyzwanie stanowi mikrobiologiczne bezpieczeństwo jaj, produkowanych w alternatywnych systemach chowu, w których kury są narażone na patogenne czynniki, związane ze zmieniającymi się warunkami klimatycznymi i mikrobiologicznymi. Jajo jest nie tylko chronione skorupą, ale także cząsteczkami przeciw drobnoustrojowymi, poprawiającymi ich bezpieczeństwo i zwiększając różnorodność produktów jajecznych, poprawiających zdrowie konsumentów.

Dzięki badaniom nad systemami żywienia i chowu, wdrożono nowe technologie, poprawiające wydajność kur i jakość jaj.

Niedawne analizy proteomiczne części składowych jaja i transkryptomiczne badania ekspresji genów w różnych odcinkach jajowodu, w których powstają kolejne elementy jaja, doprowadziły do zidentyfikowania szerokiego zakresu czynników i poznania nowych białek, biorących udział w tworzeniu jaj i w zwalczaniu patogennych drobnoustrojów.

Termin proteomika po raz pierwszy wprowadzono w 1995 r., określając proces poznawania wszystkich białek w komórkach, tkankach lub całych organizmach. Nazwę proteomika, używa się do określenia prowadzonych tylko na dużą skalę badań białek.

Transkryptomami zajmuje się nauka zwana transkryptomiką, polegająca na określaniu poziomu ekspresji genów. W badaniach wykorzystuje się techniki wykrywania i oceniania tysięcy różnych typów cząsteczek RNA, pochodzących z różnych genów, np. mikromacierze DNA. Poziom ekspresji genów może być mierzony wieloma metodami.

Bioinformatyczna analiza białkowych sekwencji, umożliwia charakterystykę ich funkcji, co prowadzi do identyfikacji transporterów jonów z macicy i białka matrycy do skorupy jaja, przyczyniając się do jej tworzenia, dostarczając mineralnych prekursorów i kontrolując wzrost kryształów. Liczne dowody in vitro i in vivo wykazały udział tych białek w budowie skorupy jaja i jej biochemiczne sekwencje.

Badając źródło uszkodzeń skorupy jaja, można określić w jaki sposób czynniki tworzące skorupę jaja są modyfikowane żywieniem kur. Geny można wykorzystać do badania przebiegu procesu mineralizacji i do określenia nowych markerów wykorzystywanych w genetycznej selekcji. Technologia ta przyczyniła się do identyfikacji wielu nowych przeciwdrobnoustrojowych białek, rozmieszczonych w różnych częściach jaja. Informacje te zostały wykorzystane do zrozumienia fizjologicznego źródła zmienności aktywności przeciwdrobnoustrojowej białka jaja lub powstałej w jaju – w trakcie leczenia kur, a także w celu zbadania możliwości stymulowania naturalnej aktywności przeciwdrobnoustrojowej jaja, przez mikrobiologiczną florę kury lub żywymi szczepionkami. Oczyszczone, przeciwdrobnoustrojowe białka-białka jaja, zapewniły alternatywne środki przeciwzakaźne dla zdrowia ludzi i zwierząt.

Priorytetem dla producentów, przedsiębiorstw hodowlanych i paszowych, jest zwiększenie nieśności kur i jakości jaj.

Postęp w uzyskiwaniu od kury większej liczby jaj, początkowo uzyskano, selekcjonując kury na osiąganie wczesnej dojrzałość płciowej i na zwiększenie szczytowej produkcji. Selekcja kur na przedłużenie okresu produkcji jaj o dobrej jakości, (Bin i in., 2016), pozwoliła na wydłużenie okresu nieśności >80 tygodni, umożliwiając w towarowych stadach, utrzymywanych do wieku 100 tygodni, osiągnięcie średniej nieśności >500 jaj/kurę/cykl. Wynik taki jest wyzwaniem dla metabolizmu i homeostazy niosek i niektórych ich narządów: wątroby – w której białka żółtek i synteza lipidów oraz jajowodu – w którym powstają białka jaja, błony skorupy i sama skorupa.
Postęp genetyczny w zwiększeniu cechy trwałości nieśności i jakości jaj wpływa na opóźnienie końca cyklu nieśności, opóźnia negatywny wpływ wieku kur – na jakość jaj. Zahamowanie produkcji jaj nie wynika z ograniczenia nieśności, lecz z wad jakości skorupy jaja, obniżenia wartości jednostek Haugh’a i witelinowej błony. Dlatego należy poprawiać jakość jaj, znoszonych przez starsze kury, poprzez lepsze poznanie fizjologicznych przyczyn wad. Metody chowu i żywienia kur mają istotne znaczenie w optymalizacji genetycznego potencjału kur, pod względem produktywności i wysokiej jakości jaj i ograniczenie demineralizacji kości lub zespołu stłuszczenia wątroby u starszych niosek (Nys, 2017).
Opracowanie nieinwazyjnych metod oceny jakości jaj, jako podstawy ich sortowania, poprawia poziom ich bezpieczeństwa (De Ketelaere i in., 2017). Zmierza się także do poprawy warunków przechowywania jaj, w celu uniknięcia obniżania ich jakości. Interesujące są doświadczenia z przechowywaniem jaj w kontrolowanej atmosferze CO2 (Beradinelli i in., 2011), poprawiające właściwości treści jaj i wartość jH. Większość sposobów kontroli jakości jaj ma charakter empiryczny, a rozwiązania oceniające wpływ jednego czynnika pokarmowego lub genetycznego na jakościową cechę, nie wyjaśniają skutku fizjologicznego metabolizmu. W ostatnich 2 dekadach skuteczne metody, stosowane w połączeniu z genomową sekwencją kurcząt i bioinformatycznymi narzędziami do przewidywania funkcji – stworzyły podstawy oceny nowych składników jaj (Guyot i in., 2017) oraz komórkowych i zewnątrzkomórkowych białek, biorących udział w tworzeniu jaja (Du i in., 2015). Ta informacja pozwala lepiej zrozumieć mechanizmy tworzenia jaja i wpływ zewnętrznych czynników na jego jakość. Przewidywanie funkcji białek jaja, na podstawie analizy ich bioinformatycznej sekwencji, sprzyja identyfikacji nowych, aktywnych cząsteczek, o szczególnych właściwościach, mających znaczenie dla zdrowia ludzi.

Identyfikacja nowych białek jaja

Sekwencja genomu kury zawiera dużą liczbę EST (Expressed Sequence Tags) reprezentujących specyficzne sekwencje mRNA), a zastosowanie metod proteomiki i transkryptomiki, doprowadziło do identyfikacji dużej liczby białek obecnych w jaju lub zaangażowanych w jego tworzenie (Gautron i in., 2011). W 2006 r. w jaju było zidentyfikowanych ok. 50 białek, ale dzięki zastosowaniu spektometrii masowej, ich ilość przekracza obecnie >1000. Tworzenie jaj przebiega w precyzyjnej sekwencji czasowej i przestrzennej, w wyniku syntezy i wydzielanie przez błonę witelinową białek jaja i jego skorupy. W ostatniej dekadzie zidentyfikowano bardzo dużą liczbę białek jaja, w tym główne wcześniej określane klasyczną, biochemiczną metodą. Niektóre z nich występują w bardzo małej ilości i mogą pochodzić z komórek nabłonkowych i gruczołowych, wyściełających jajowód. Ich identyfikacja metodami bioinformatycznymi, pozwala odkryć funkcję oraz zidentyfikować nowe białka, zaangażowane w tworzenie jaja lub w jego terapeutyczne cząsteczki.

 

Tworzenie skorupy jaja

Jajo ma skuteczną ochronę w postaci wapiennej skorupy, a żywieniem, dodatkami do paszy, właściwymi metodami hodowli i chowu kur poprawiono nieśność i jakość jaj.

Badania budowy skorupy jaja wykazały jej skomplikowaną budowę i jakie są mechanizmy oraz czynniki, zaangażowane w jej tworzenie. Skorupa powstaje w wyniku wydzielania wapnia i dwuwęglanu, co przyczynia się do osadzania CaCO3, z szybkością
0,33 g/h, między 10 a 22 godzin po owulacji (Nys i Guyot, 2011).
Wg Nys i in., (1999) charakterystycznymi cechami wydzielania Ca2+ w macicy są:

  • niezdolność macicy do codziennego przenoszenia Ca+ i HCO3;
  • jej synchronizacja z procesem owulacji w dziennym cyklu owulacyjnym;
  • stymulacja owulacji obecnością jaja w rozszerzonej macicy.

Wapń przenoszą głównie komórki gruczołowe macicy, co potwierdza obecność w nich kalbidyny i anhydrazy węglanowej (Wasserman i in., 1991). Dotyczy to również wielu innych jonów (Na+, K+. Cl-, H+), uczestniczących w procesie wydzielania wapnia oraz w utrzymaniu komórkowej, jonowej homeostazy (Brionne i in., 2014). Komórki macicy, przenoszą do niej dużą ilość wapnia, w zależności od stopnia jego stężenia. Ca2+ nie jest przechowywany w moczowodzie przed zwapnieniem skorupy jaja, ale pochodzi
z osocza krwi. Źródłem wodorowęglanu jest bierna dyfuzja CO2, przez błonę komórkową, a jego transfer następuje w trzech etapach, podczas lub poza tworzeniem się skorupy jaja:

  • obniżone stężenie dopływającego Ca2;
  • wewnątrzkomórkowy transport Ca2 z udziałem i przechowywanie Ca w endoplazmatycznej siateczce;
  • aktywne wtłaczanie do światła macicy Ca2+.

Wydzielany Ca2 przez nabłonkowe, gruczołowe komórki i plazmatyczną błonę, przy niskim wewnątrz komórkowym stężeniu, ma duże znaczenie dla przeżywalności komórek.
Prekursor wodorowęglanu kalcytu w skorupie pochodzi głównie z CO2 zawartego w krwi i jest dostarczany w niewielkich ilościach z plazmy.

 

Biomineralizacja skorupy jaja

Skorupa jaja jest porowatym, bio-ceramicznym tworzywem, który powstał w temperaturze ciała, w środowisku wolnym od komórek. Tworzy się w ograniczonej przestrzeni, końcowego odcinka jajowodu ptaka, w płynie macicznym, przesyconym wapniem i biowęglanem i zawiera organiczne prekursory macierzy skorupy.

Charakterystyczną cechą CaCO3 jest postać kalcytu zbliżona do mineralnego złoża, a także brak komórek odpowiedzialnych za tworzenie się zewnętrznych błon skorupy (Nys i in., 1999). Wielokierunkowy wzrost kryształów kalcytu w stronę zewnętrznej powierzchni prowadzi do tworzenia odwróconych stożków, które łączą się tworząc zwartą warstwę. Początkowo minerał skorupy jaja pochodzi z nagromadzonych cząstek amorficznego węglanu. Później zaczynają się rozrastać kryształy z sąsiednich miejsc (Garcia-Ruiz i Rodrigues-Navarro, 1994). Ten wysoki stopień organizacji budowy, wynika z jednej strony z rywalizacji o przestrzeń między kryształami z sąsiednich miejsc a z wpływem węglanu wapnia, na organiczną matrycę, podczas fazy powstawania. Białka i proteoglikany organicznej matrycy, działają z węglanem wapnia, tworząc kryształy kalcytu, a następnie hamują ich wzrost. Ponadto, w skład skorupy wchodzą białka, specyficzne dla cieśni i macicy jajowodu (Hincke i in., 2012).
Proteomiczna, ilościowa analiza białek, płynu macicznego, w którym zachodzi mineralizacja skorupy, podczas etapów jej tworzenia, ujawnia obecność aktywnych białek (OC17, C 116, EDIL3, LOXL2, ovoalbubin, ovotransferyn, lizozymem itp.)
i ich zaangażowanie w proces tworzenia skorupy jaja (Marie i in., 2015).
Znaczące powiązania między cechami jakości skorupy a polimorfizmem ich genów, wskazują na wpływ białek organicznej matrycy, na budowę skorupy jaja. Polimorfizm genu ovolabumin jest związany z wytrzymałością, deformacją i grubością skorupy oraz wielkością kryształów; OC116 z twardością skorupy, modułem sprężystości i ukierunkowaniem kryształu; APP1 z wytrzymałością skorupy; owotranferryna z wielkością kryształów, a OCX-32 z grubością skorupy i ukierunkowaniem kryształów (Sun i in. 2016).

Przeciwdrobnoustrojowe białka jaj

Identyfikacja nowych cząsteczek

Wg Guyot i in., (2017), głównymi białkami jaja o przeciwdrobnoustrojowych właściwościach, są lisozym, ovotransferyna, niektóre inhibitory proteazy (ovomukoid, ovoinhibitor, ovistatyna i cystatyna) oraz avidyna-białko wiążące ryboflawinę. Ostatnio w skorupie
i błonie witelinowej jaja zidentyfikowano dodatkowe białka. Ptasie, kationowe białko, bogate w cysteinę, które są naturalnymi składnikami białka obronnego gospodarza, co wcześniej stwierdzono u bezkręgowców, roślin i innych kręgowców. Cząsteczki te mają na ogół szeroki zakres działania przeciw bakteriom Gram – dodatnim i Gram – ujemnym oraz przeciw grzybom i wirusom. Wykazują aktywność przeciwbakteryjną przeciw Salmonella Enteritidis, Salmonella Tiphimurium, Escherichia coli, Listeria monocytogenes i Staphylococcus aureus (Herve-Grepinet i in., 2010).
Gallin jest kationowym peptydem, o 3 siarczkowych wiązaniach i bardziej ograniczonym antybakterynym działaniu. Syntetyczna galina jest aktywna tylko przeciwko E. coli, nie działając przeciwko Salmonella enterica, Staphylococcus aureus i Listeria monocytogenes (Herve et ol. 2014). Wśród innych białek jaja – Teno jest białkiem lipopolisacharydowym, zwiększającym przenikalność bakteryjną do podniebienia, płuc i nabłonka nosa i może uczestniczyć w uszkodzeniach wewnętrznych błon.
Wyizolowane z białka jaja Emu, działa przeciw niektórym bakteriom Gram – dodatnim, ale nie przeciw Gram – ujemnym, takim jak Escherichia coli i Salmonella Tiphimurium (Maehashi i in., 2014). Białko X, związane z owoalbuminą, należy do rodziny inhibitorów serynowej proteazy i jest 100 razy mniej skoncentrowane niż albumina w białku jaja kurzego, wykazując duże podobieństwo do sekwencji z albuminą. Wg Rehault-Godbert i in., (2013).OVAX, w przeciwieństwie do albuminy jaja kurzego, wykazuje aktywność przeciw bakteriom Listeria monocytogenes i Salmonella Enteritidis.
Składniki białka jaja, mogą oddziaływać synergicznie, a warunki fizykochemiczno/środowiskowe (temperatura, pH treści jaja, jej lepkość, CO2 i skład jonowy) wpływają na wzrost bakterii i przeciwbakteryjną aktywność białka jaja (Guyot i in., 2017). Genetyka, wiek, stan immunologiczny kur i warunki przechowywania jaj, wpływają na przeciwdrobnoustrojowe właściwości, decydując o jego przydatności technologicznej. Skrajne warunki chowu, konwencjonalnych, niezakażonych kur, w różnym stopniu obciążonych bakteriami, nie ujawniły antybakteryjnych właściwości białek jaj (Bedrani et al., 201w3).
Właściwości białka jaja przeciwko Staphylococcus Aureus i Steptococcus uberis zostały zwiększone w grupach kur od określonych patogenów, w porównaniu z grupą wolną w ogóle od zarazków, potwierdzając, że aktywność przeciwbakteryjna białka jaja, może być stymulowana drobnoustrojami. Na aktywności lizozymu i antyproteazy, nie wpływały znacząco warunki chowu.

Wpływ przechowywania jaj na ich przeciwdrobnoustrojową aktywność

Wpływ przechowywania jaj na właściwości fizykochemiczne ich białek jest dobrze znany, ale skutki przeciwdrobnoustrojowej aktywności białka jaja, nie zostały dokładnie zbadane.
Podczas przechowywania jaj, aktywność przeciwdrobnoustrojowych białek w białku jaja, jest obniżana przez zasadowe pH i warunki przechowywania (czas, temperatura). Badania proteomiczne przeprowadzone na jajach przechowywanych w trzech różnych temperaturach (4OC, 20OC, 37OC), ujawniły w białku jaja tworzenie białkowych kompleksów wraz ze wzrostem temperatury przechowywania (Qiu i in., 2012). Przechowywanie jaj przez 28 dni w temperaturze 15OC obniżyło aktywności lizozymu o 4% – 17% w białku jaja (Trziszka i in., 2004). Antychymotrypsyny i antypapainy w białku jaja nie zmieniały swej aktywności w zależności od czasu lub temperatury przechowywania, z tym że aktywność antytrypsyny spadała po 2 tygodniach przechowywania jaj w temperaturze 37OC (Rehault-Godbert i in., 2010).

Przechowywanie jaj nie starszych niż 1 tydzień, w temperaturze 20OC, sprzyja rozwojowi bakterii Salmonella bardziej, niż w przechowywanych 2-4 tygodni w takiej samej ciepłocie (Duboccage i in., 2001).

Porównanie jaj przechowywanych przez różny czas w różnej temperaturze (Rehault-Godbert i in., 2010) wykazuje, że przeciwbakteryjna aktywność białka jaja, znacznie wzrasta w ciągu kilku dni po jego zniesieniu. Aktywność była większa po kilku dniach od zniesienia jaja, przy temperaturze przechowywania 37OC, ale po 2 tygodniach, stopniowo spadała. Niektóre warunki przechowywania jaj, wzmacniają antybakteryjne działania białka jaja, choć jego molekularne mechanizmy pozostają nieznane.

Innowacyjne, terapeutyczne cząsteczki

Niektóre nowe, przeciwdrobnoustrojowe białka, oczyszczone lub skoncentrowane we frakcjach białka jaja, mogą być stosowane w poprawie ludzkiego zdrowia. Niskie jednak stężenie tych białek i ich pochodzenie od zwierząt, mogą ograniczyć dalszy rozwój ich zastosowań. Alternatywnie można wykorzystać syntetyczne peptydy lub poddany częściowej proteolizie-materiał pozyskany z jaj.

Peptydy pozyskane z jaj

Peptydy pozyskane z białka i żółtka jaja oraz witelinowych błon, od dawna są uznawane za bioaktywne cząsteczki, działające przeciw nadciśnieniu, utlenianiu, stanom zapalnym i drobnoustrojom oraz stymulujące immunomodulację, (Meran i in. 2017). Większość aktywnych peptydów, pochodzących z jaj, uzyskano in vitro po proteolizie oczyszczonych białek jaja trawiennymi enzymami takimi jak pepsyny, trypsyny i chymotrypsyny. Peptydy takie mogą występować w przewodzie pokarmowym po spożyciu jaj, przyczyniając się do poprawy stanu zdrowotnego konsumenta.

Stymulacja składników jaja do rozwoju zarodka sugeruje, że badając dynamikę i wytwarzanie naturalnych peptydów, pochodzących z inkubowanych jaj, można wykryć działania związane z obroną zarodka i regulacją jego wzrostu.

Brak jest jednak informacji dotyczących peptydomów w jaju, podczas rozwoju zarodkowego.
Wg (Basilicata i in., 2018), uzyskane informacje o odrębnej i różnorodnej aktywności oraz bioinformatycznych narzędziach, służących do oczyszczenia lub koncentrowania ich we frakcjach białka jaja, mogą zwiększyć pozyskiwanie hydorolizatów w wyniku proteolizy lub chemicznej syntezy.

 

Wnioski

Identyfikacja nowych białek jaja i jajowodu umożliwiła rozszyfrowanie mechanizmów tworzenia jaj i opracowanie nowych cząsteczek, stosowanych w poprawie ludzkiego zdrowia.

Bardzo skuteczne metody, początkowo były jakościowe i opisowe, a stosowana obecnie proteomika, jest bardziej ilościowa, umożliwiając badanie na dużą skalę białek, dostarczających prekursorów, zaangażowanych w tworzenie skorupy jaja i w ocenę właściwości jego wszystkich elementów. Ilościowa analiza może być wykorzystana do zbadania regulacji syntezy aktywnych białek w procesie tworzenia jaja, poprzez zbadanie wpływu genomu lub cech fizjologicznych kury, na ich zmianę. Można także wyjaśnić, w jaki sposób niektóre dodatki żywieniowe, mogą poprawić cechy jakości jaj. Informacje o polimorfizmie białek, wykorzystuje się do doskonalenia metod selekcji kur i poprawy ich produkcyjności. Metody te nie tylko są wykorzystywane do poprawy jakości kurzych jaj, lecz także są przedmiotem zainteresowania innych branż np. farmaceutycznej.