Dr inż. Ryszard Gilewski
Prof. dr hab. Stanisław Wężyk

Metagenomika, zwana także genomiką środowiskową, ekogenomiką, a także genomiką populacji drobnoustrojów jest nową techniką polegającą na klonowaniu DNA pozyskiwanego bezpośrednio z naturalnych środowisk i następnie sekwencjonowaniu ogromnych bibliotek genomowych. Ten nowy kierunek badań, zrewolucjonizuje zrozumienie i postrzeganie świata mikrobiologii (Kulisiewicz, 2007).

Mikrobiom jelita drobiu, którego określenie zaproponował Joshua Lederberg (XX/XXI w.), stanowią genomy, występujących w nim mikroorganizmów (Tremaroli i Backhed, 2012). Bierze on udział w regulowaniu wielu metabolicznych procesach, poznanie związków między nim a żywicielem, informuje o nowych sposobach poprawy zdrowia i produkcyjności. Metagenomika jest metodą analizy genomu, złożonego z mikroorganizmów, zasiedlających określony mikrobiom. Sekwencjonując fragmenty genomu, można ocenić genetyczną różnorodność mikroorganizmów oraz ich wpływu na ekologię badanego środowiska. Wyniki sekwencjonowania mikrobiomu i utrzymania jego homeostazy, są cenną informacją dla ochrony środowiska, jak i szeroko pojętego przemysłu, w tym farmaceutycznego.
Obecnie są dostępne metagenomiczne techniki, analizowania uzyskanych wyników oraz metody taksonomiczne i genowe.

W produkcji drobiu poznano mikrobiomy kolonizujące tuszkę drobiową i geny oporne na antybiotyki oraz podstawowe zagadnienia, służące w metagenomicznych badaniach (Cesare, 2018).

Metagenomika

Metagenomika bada funkcjonalne działania drobnoustrojów i ich metaboliczne zdolności oraz interakcje między poszczególnymi mikroorganizmami. Obejmuje klonowanie, sekwencjonowanie i funkcjonalną analizę genetycznego materiału, izolowanego z różnych nisz ekologicznych.
Wg Handelsmana i in., (1998), metagenomika stała się nową dziedziną mikrobiologicznej ekologii mikroorganizmów. W przypadku drobiu polega na badaniu metagenomu, tj. całkowitego DNA, wyekstrahowanego z określonego miejsca ptaka, pozwalając na dokładniejsze poznanie populacji mikroorganizmów.
Badania metagenomiczne prowadzono początkowo na hodowli klonowanych kultur, a następnie na przesiewowych badaniach funkcjonalnej ekspresji (Handelsman i in., 1998). Naturalne populacje drobnoustrojów, charakteryzują się dużą różnorodnością bakterii, wirusów i innych chromosomowych i poza chromosomowych elementów genetycznych.
Zastosowanie technologii sekwencjonowania umożliwiło wykorzystanie, metagenomicznych analiz. Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), określane również jako sekwencjonowanie masowe, równoległe, jest doskonalsze od ograniczonego, tradycyjnego sekwencjonowania. Wg Thomas i in. (2012), metodami NGS, uzyskuje się bardzo efektywne wyniki, przyczyniając się do rozwoju metagenomicznych analiz sekwencji, określających całe, mikrobiologiczne populacje.

Na podstawie zastosowanego procesu sekwencjonowania, technologie NGS dzielą się na kilka typów, wyjaśniając następujące zagadnienia:

  • strukturę populacji, w tym podział i liczebność różnych gatunków;
  • genowy wkład każdego członka populacji, w tym liczbę i możliwości funkcjonalne;
  • heterogeniczność wewnątrzgatunkowych genów (Scholz i in., 2012).

Metagenomika markerów genetycznych i tzw. mutagenomiczny „shotgun”

Sekwencjonowanie genomu organizmu polega na ustaleniu kolejności nukleotydów jego materiału genetycznego. Główną przeszkodą na drodze poznania pełnej sekwencji nieznanego genomu, czyli tzw. sekwencjonowania, jest dysproporcja między jego rozmiarem a stosowanymi technikami sekwencjonowania. Aby ten problem ominąć, wykorzystuje się różne odmiany metody „shotgun”, w której całkowita sekwencja, składa się z dużego zbioru, częściowo zachodzących na siebie fragmentów.
Jednym z miejsc sekwencjonowania, jest zmienny region w kodującym genie 16S rRNA bakterii, który ma
9 zmiennych regionów, określanymi jako miejsca początków reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Zmiany sekwencji w tych regionach, pozwalają na dokładną, taksonomiczną ocenę, przez porównanie z sekwencjami genu 16S rRNA, dostępnymi w różnych bazach danych. Wg Cole i in. (2014), całkowicie zsekwencjonowany gen 16S rRNA, jest skupieniem prawie identycznych fragmentów operacyjnych jednostek taksonomicznych (OTU).

Poza taksonomicznym składem, metagenomika genomu każdego członka badanej populacji, informuje o jego liczebności i funkcjonalnych zdolnościach, a także o wewnątrzgatunkowej heterogeniczności genów (Scholz i in., 2012).
Wyniki sekwencji „shortgun”, informują o organizmach tworzących populację i jej funkcjonalnych genach. Metagenomicznym sekwencjonowaniem winno się ocenić każdy związek między danym mikroorganizmem, a jego zestawem genów.

Identyfikacja i łączenie genomów oraz genetycznych elementów

Metagenomiczną metodę „shotgun”, zastosowano w tysiącach badań nad wspomagającymi genami, obejmującymi miliony próbek. Po ich metagenomicznym podziale, głównym zadaniem jest analiza ogromnej ilości danych. Najprostszą analizą metagenomu jest użycie krótkich odczytów bezpośrednio filtrowanej sekwencji (Thomas i in., 2012). W wyniku analiz uzyskuje się taksonomiczną i funkcjonalną ocenę pojedynczych zbiorów danych, pozwalającą szybko określać cele i hipotezy, utworzone w wyniku badań. Wg Mende i in. (2012), składanymi algorytmami można odtwarzać krótkie odczyty nakładających się sekwencji, reprezentujących ciągły fragment DNA. Dane te wystarczają do scharakteryzowania głównych funkcji populacji drobnoustrojów i przypisania ich do genomowych baz danych (Howe i in., 2014).
Obecne strategie analizy metagenomicznych danych opierają się w dużej mierze na porównaniu z referencyjnymi danym tj. dotyczącymi tylko bakterii i wirusów. Bakteryjne genomy różnych izolatów tego samego gatunku, są bardzo heterogenne, co może wynikać z różnic w klonowaniu środowiskowej adaptacji lub z procesu uprawy gleby (Nielsen i in., 2014).

Referencyjne genomy są niewielką częścią biologicznej różnorodności i mikrobiologicznych układów, a oparte na nich metody, ograniczają metagenomiczną analizę oraz możliwość segregowania danych metagenomicznych na spójne jednostki biologiczne. Złożenie genomu de novo, ze złożonych matagenomicznych danych, jest trudne z powodu wielu, niejednoznacznych sekwencji. Typowy, metagenomiczny zespół, stanowi duży zestaw, niezależnych elementów, które trudno połączyć w biologiczne jednostki (Wooley i in., 2010).

Metagenomiczne sekwencjonowanie w taksonomii jelita kur

Mikrobiom przewodu pokarmowego drobiu jest ekosystemem złożonym z wielu różnych mikroorganizmów, odgrywając ważną rolę w utrzymaniu prawidłowego funkcjonowania jelit i zdrowia gospodarza, a brak równowagi lub zaburzenia w nim, wpływają ujemnie na jego procesy fizjologiczne. Szacuje się, że można laboratoryjnie hodować 10-60% bakterii jelita ślepego, a około 45% – bakterii jelitowych kurcząt, można przypisać znanemu rodzajowi (Apajalathi i in., 2004). Dlatego duża część niezbadanego mikrobiomu, stanowi główne źródło niewykorzystanych biologicznych możliwości nowo zidentyfikowanych bakterii, enzymów i probiotycznych szczepów bakteryjnych (Stanley i in., 2014).

Populacje bakterii pochodzące z różnych części kurcząt, tak się różnią, że należałoby traktować je jako oddzielne i silnie połączone ekosystemy, wpływające na całą jelitową mikroflorę (Stanley i in., 2014).

Jelita ślepe ptaków, są ważnym miejscem fermentacji, wpływając na ich zdrowie i wydajność, dlatego profile ich mikrobiomów – są dokładnie badane. Mają one zdolność trawienia pokarmów bogatych w celulozę, skrobię i polisacharydy. Są one głównym miejscem absorpcji wody oraz transportu i wchłaniania składników odżywczych.
De Cesare i in. (2017) badając u jednodniowych piskląt skład mikrobiomów jelit ślepych stwierdzili, że ponad 95% populacji bakterii, stanowiły Firmicutes (typ na ogół gram-dodatnich bakterii) – 85,5% i Proteobacteria – 9,61%. Częstość występowania Firmicutes u jednodniowych piskląt była istotnie niższa niż u 41-dniowych kurcząt, a częstotliwość występowania Proteobacteria – była istotnie wyższa.

Ocena genetycznego składu jelita kurcząt

Badania metagenomiczne wyjaśniają in vivo wzajemne powiązania między metabolicznymi szlakami, wynikającymi z interakcji w mikrobiomach i między mikrobiomem – a żywicielem. Metagenomiczną analizą bada się, które bakterie mają specyficzne geny – kodujące enzymy, związane z metabolicznymi szlakami. Segeant i in. (2014), opisali u kurcząt 108103 kompletnych kodujących sekwencji (CDS).

Udowodniono istnienie 500 polisacharydowych systemów utylizacji, w tym przedstawicieli nowej klasy systemów, zawierających endoksylanazy β1-4.

De Cesare i in. (2017), zbadali genom bakterii w jelicie ślepym kurcząt w wieku 1 i 41 dni wykazując, że średnie odchylenie od szlaków metabolicznych i genetycznej informacji u 1-dniowych piskląt, wynosiło odpowiednio 20,9% i 16,2%. Wartości te były wyższe po 41 dniach, tj. odpowiednio 53,8 i 55,8%. Przykłady te pokazują możliwości zastosowanie analizy metagenomicznej do określenia miejsca genów w jelitach kurczaka, by zweryfikować ich rozkład i związki ze szlakiem metabolicznym u różnych grup bakterii.

Zastosowanie metagenomiki w poprawie wykorzystania pasz

Wykorzystanie paszy służy do oceny skuteczności metabolizmu składników odżywczych i energii, a jego poprawa, obniża koszty ponoszone przez producentów, pozwala zachować dodatkowe zasoby pokarmowe dla ludzi oraz zmniejsza ilości odchodów i emisję gazów cieplarnianych. Współczynnik wykorzystania paszy (FCR) i spożycie resztkowej paszy (RFI), są głównymi wskaźnikami oceny wykorzystania paszy. FCR od dawna jest stosowany w hodowli i chowie drobiu, ze względu na duży wpływ na wzrost gospodarczy. RFI służy do pomiaru wydajności paszy w produkcji zwierzęcej, z powodu jej fenotypowej niezależności – od utrzymania i przyrostu masy ciała.

Wykorzystanie paszy jest cechą złożoną, ponieważ wpływa na nią nie tylko genotyp i fizjologiczny stan gospodarza, ale także jego mikroflora jelitowa, oddziałująca na trawienie składników odżywczych i absorpcję energii przez ptaka (Yan i in., 2017).

Singh i in., (2014) badając różnicę między populacjami drobnoustrojów w kale brojlerów, o dobrym i słabym wykorzystaniu paszy stwierdzili, że bakterie Acinetobacter, AnaerosporobacterArcobacter, dominowały w grupie kurcząt o niskiej wydajności, natomiast Escherichia/Shigella, FaecabacteriumHelicobacter – w grupie o lepszej wydajności. Pod względem liczebności LactobacillusBacteroides, występowały w obu grupach na podobnym poziomi. Yan i in. (2017) badali rolę mikroflory dwunastnicy, jelita ślepego i kału, jako wydajność resztkowego żywienia kur (RFI). Analiza mikrobiotu sugerowała, że dominujące drobnoustroje w dwunastnicy i kale, są do siebie bardziej podobne niż zasiedlające jelito ślepe. Bardziej różnorodne mikroorganizmy były w jelicie ślepym niż w pozostałych dwóch miejscach. Istotnie różnice między wysoką (BFE) a niską wydajnością paszy (PFE), były w jelicie ślepym. W grupie BFE miały większy udział bakterie LactobacillusAkkermensi, Bacteroides coprophilus, Lactobacillus delbrueckii, Veillonella dispar, Lactobacillus reuteri
Prochlorococcus marinus, natomiast w grupie PFE dominowały Facelibacterium prausnitzii, Parabacteroides distasonisThermobiospora bispora. Wyniki te wskazują na znaczącą rolę mikroflory jelita ślepego w trawieniu paszy przez kurczęta i sugerują zastosowanie bakterii Lactobacillus, w celu poprawy wykorzystania paszy przez brojlery.

Metagenomiczne mapowanie różnych genów oporności na antybiotyki

Metagenomika znalazła zastosowanie w badaniach nad genami antybiotykowymi (ARG) w produkcji drobiu. Mikroflora kału zwierząt jest olbrzymim zbiornikiem genów ARG, wykorzystywanym przez fizjologiczną florę i patogeny (Xiong i in., 2018). Bakterie oporne na antybiotyki i wydalane przez ptaki ARG, mogą być przenoszone do środowiska, przez obornik, odpływy i cząstki stałe znajdujące się w powietrzu, przyczyniając się do wywołania odporności w środowisku (Xiong i in., 2018).

WHO zainicjowała w 144 krajach 4-letnie badania nad opornością na antybiotyki, publikując w 2014 raport na ten temat. Parlament UK opublikował notatkę zatytułowaną „Antybiotykooporność w środowisku” (2013), a amerykański Biały Dom wydał zarządzenie w sprawie krajowej strategii (2014) na rzecz zwalczania oporności na antybiotyki (Yang i in., 2016).

Xiong i in., (2018), zastosowali metagenomiczne sekwencjonowanie, w celu zbadania różnic w ARG i ilością bakterii w kale brojlerów, leczonych przez 5 dni niską dawką (0,2 g/l) i terapeutyczną dawką (2 g/l) chlorotetracykliny w wodzie pitnej. W wyekstrahowanym DNA określono poziom ARG, stwierdzając, że terapeutyczna dawka chlorotetracykliny, hamowała geny wielolekowej oporności, promując geny oporności na tetracyklinę. Zmniejszenie wielolekowej oporności genów było związane ze zmniejszeniem udziału Proteobakterii i Escherichia/Shigella z 72 do 58%. Zwiększenie liczebności genów oporności na tetracyclinę było spowodowane pojawieniem się Bifidobacterium. Zmiany w budowie antybiotyku, spowodowane kałowymi mikrobami, towarzyszą zmianom liczebności bakterii gospodarza, przenoszących specyficzne ARG w mikroflorze kału.

Metagenomiczne badania tuszek drobiowych

Mała ilość publikacji nt. mikrobiotu żywności było wynikiem opinii, że populacje mikroorganizmów żywności, są mało zróżnicowane. Rozwój i zastosowanie metagenomicznhych metod, w dziedzinie ekosystemów żywności, ujawniły ich dużą zmienność oraz istotną rolę, jaką mogą odgrywać niektóre z nich (Kergourlay i in., 2015).
De Cesare i in. (2018) zastosowali sekwencjonowanie metagenomiczne w celu zbadania profilu mikrobiologicznego tuszek, różnie żywionych kurcząt, stwierdzając między grupami różnice, między takimi gatunkami bakterii jak Clostridium perfringens Salmonella enterica, które mają bezpośredni wpływ na profil bezpieczeństwa żywności.

Co dalej?

W metodach metagenomiki drobiu, należy pilnie rozwiązać dwa podstawowe problemy. Pierwszy dotyczy liczby ptaków, z których powinna się składać każda grupa doświadczalna, a drugie zagadnienie dotyczy ilości niezbędnych sekwencjonowań, by ujawnić rzadziej występujące gatunki czy nawet szczepy bakterii. Należy także określić pojęcie sekwencjonowania, bez którego stosowanie taksonomicznych i funkcjonalnych analiz genów, wewnątrz oraz między doświadczalnymi grupami, a także czasem i przestrzenią – będzie mało wartościowe (De Cesare, 2018).
Nielsen i in., (2014) zaproponowali metodę opartą na segregowaniu genów obecnych w ludzkich, metagenomicznych próbkach, umożliwiających odkrycie nowych bakterii, wirusów i współdziedziczonych jednostek genetycznych, bez użycia referencyjnych genów. Autorzy zbadali 396 próbek ludzkich meta genomów jelitowych, wykorzystując jako wzorcowy gatunek, podgrupę Bifidobacterium animalis subsp. lactis, ponieważ 19 próbek pochodziło od osób, które spożyły produkt, zawierający ten szczep. Wyniki pokazały, że przy współbieżnym profilowaniu szczepu, można go dokładnie segregować, używając zaledwie 18 próbek (Nielsen i in., 2014). Nawet przy małej biologicznej zmienności między ptakami należącymi do tej samej doświadczalnej grupy, uzyskane parametry, powinny być pożyteczne dla nauk drobiarskich.
Na wybór sekwencjonowania, największy wpływ mają jego koszty. Aby ujednolicić zestaw parametrów i próg sekwencjonowania, Komisja Europejska sfinansowała projekt pt. Horyzont 2020 COMPARE (porównaj), uwzględniający nowe technologie, w szybszym wykrywaniu i reagowaniu na epidemie chorób, występujące wśród ludzi i zwierząt na całym świecie.

Wnioski

Wpływ mikrobiomu przewodu pokarmowego kurcząt, na ich produkcyjność i zdrowie oraz na jakość mięsa, jest przedmiotem intensywnych badań. Skład jelitowego mikrobiomu, jego metaboliczne funkcje i wpływ na zdrowie, dobrostan i wydajność, jest daleki do całkowitego, metagenomicznego zsekwencjonowania i wydaje się być jedną z najbardziej skutecznych, strategii badawczych, która może wypełnić tę lukę wiedzy.
Metagenomika „shotgun” zapewnia również sposób badania niehodowalnych mikroorganizmów, które są trudne lub niemożliwe do analizy. W przeciwieństwie do sekwencjonowania kapilarnego lub rozwiązań opartych na PCR, sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), umożliwia naukowcom równoległe sekwencjonowanie tysięcy organizmów.