Dr inż. Ryszard Gilewski
Prof. dr hab. Stanisław Wężyk

Mikrobiota jelitowa, tradycyjnie nazywana florą bakteryjną jelit, mikroflorą jelitową, stanowi zespół mikroorganizmów – głównie bakterii, tworzący w układzie pokarmowym, złożony ekosystem, zwany mikrobiomem, będący u ptaków jednym z elementów ich fizjologicznej bioty.

Fizjologiczna biota drobiu – nazwa mikroorganizmów występujących w organizmie np. kury i niewywołujących chorobowych objawów. W związku z tym, że bakterie nie należą do królestwa roślin, bardziej odpowiednią nazwą byłaby tutaj – „biota fizjologiczna drobiu”.

Rozwój mikobioty jelit u kurcząt towarowych, następuje pod wpływem stopniowo zasiedlających ich przewód pokarmowy bakterii Proteobacteria, FirmicutesBacteroidetes.

U ptaków, na ten rozwój można wpływać doustnym podawanie mikroflory jelita ślepego lub kału oraz terapią antybiotykową. Firmicutes to główni producenci maślanu, natomiast Bacteroidetes odpowiedzialne są za produkcję propionianu, wpływają na przemianę złożonych polisacharydów. Bakterioidetes są odmienną od normalnych bakterii formą, powstałą w wyniku niekorzystnych warunków rozwojowych. Kurczęta reagują na kolonizację jelit mikroorganizmami, wytwarzaniem i wydzielaniem przeciwciał.

Rozwój mikrobiota przewodu pokarmowego kur

Wg Lu i in. (2003), kolonizacja bakteriami przewodu pokarmowego ciepłokrwistych zwierząt, rozpoczyna się natychmiast po ich urodzeniu lub wykluciu, poprzez kontakt z rodzicami, jako pierwszymi dawcami pożytecznej mikroflory. Zasiedlanie jelit inicjują beztlenowe bakterie z rodziny Enterobecteriaceae, by w ciągu pierwszych 7 dni po wykluciu – rozwinęły się Firmicutes, a po nich, by kolonizację zakończyły – Bacteroidetes.
Rozwój jelitowej flory u kurcząt towarowych, wylęgniętych w wylęgarni, charakteryzuje się brakiem kontaktu między nimi a dorosłymi kurami (kwokami). Początkowa kolonizacja przewodu pokarmowego piskląt zależy od mikroflory wylęgarni lub wychowalni, wolne od bakterii jelita, stanowią idealne warunki dla ich namnażania się. Dlatego wg Hoszowskiego i Truszczyńskiego (1997), kurczęta o przewodzie pokarmowym zasiedlonym pożądaną mikrobiotą, zapobiegającą zakażeniom patogenami, są wykorzystywane w wielkotowarowej, intensywnej produkcji.

Podczas całego życia kurczaka, Videnska i in. (2014), wyróżniają 4 etapy rozwoju mikrobiota. Pierwszy etap (pierwszy tydzień życia kurcząt), charakteryzuje się dużą liczebnością bakterii rodzaju Proteobacteria (ok. 50% mikroflory), reprezentowanych głównie przez rodzinę Enterobacteriaceae i rodzaj Escherichia, a pozostała część mikroflory jelita ślepego u kurcząt w tym wieku, stanowią bakterie rodziny Lachnospiraceae (gromada Firmicutes).

Trzeci etap rozwoju mikroflory jelita ślepego, charakterystyczny jest dla kurcząt w wieku od 2 do 4 miesięcy, gdy następuje stopniowy rozwój Firmucutes, które zastępują bakterie rodzaju typy Bacteroidetes, stanowiły 55% całkowitego mikrobiomu
jelita ślepego kur. Bacteroidetes. Pierwsze bakterie gromady Rikenellaceae (rodzaju Alistipes) pojawiły się w 4 tygodniu, a następne – przedstawiciele PorphyromonadaceaeBacteroidaceae – u 12-tygodniowych kurcząt.
Czwarty etap był charakterystyczny dla kur starszych niż 7 miesięcy, których mikroflorę jelita ślepego, tworzyły głównie bakterie FirmicutesBacteroidetes, każde po połowie liczebności mikrobiomu. Liczebność Bacteroidaceae, zauważone po raz pierwszy w 12 tygodniu, występowały do 14 tygodnia życia w ilości nieprzekraczającej 2% całkowitej mikroflory, która potem zwiększała się o ok. 10 – 30% całkowitego mikrobiomu.
W stadium 4, Proteobacteria ponownie pojawiły się w mikrobiomie jelita ślepego 34 – tygodniowych kur, obejmując ok. 5% całkowitej mikroflory, przy czym ogólny skład tych bakterii w jelicie ślepym kur w tym wieku lub starszych i 1-dniowych piskląt-był inny, gdyż u starych kur, dominowały bakterie rodzaju Desulfovibrio. Drobnoustroje w jelicie ślepym kurcząt starszych, >6 tygodni, stwierdzano znacznie rzadziej.
Zhao i in., (2013) zaobserwowali ok. 37% Fimicutes i 10% Bacteroidetes u 8-tygodniowych kurcząt, a Nordentoft i in. (2011) scharakteryzowali mikroflorę jelit 18-tygodniowych kur, zasiedlonych głównie przez te bakterie i mniej liczebne populacje, należące do gromady Proteobacteria, ActinobacteriaFusobacteria. Badania nad zaburzeniami wywołanymi antybiotykową terapią wykazały, że mikroflora 15-tygodniowych, kontrolnych kurcząt, różniła się od mikroflory 46-tygodniowych kur – liczebnością Clostridiales, dominujących w kale młodszych ptaków (Rychlik, 2018). Wg Callaway i in. (2009), u 76-tygodniowych kur, 2/3 bioty stanowiły bakterie Bacteroidetes. Scharakteryzowano także mikroflorę kałową brojlerów i kur pochodzących z różnych krajów europejskich, stwierdzając, że mikrobiobioty u 3-4 tygodniowych brojlerów, wzbogacone o bakterie Firmicutes, a Bacteroides, zasiedlały głównie jelita dorosłych kur (Videnska i in., (2014). Wyniki długotrwałych badań są bardziej wiarygodne, mimo że różnią się między sobą, genetycznymi grupami i rodzajem bakterii.

Modyfikowanie składu mikrobioty

Ponieważ wg Videnskiej i in., (2014), Enterobacteriaceae są zastępowane u 2-tygodniowych kurcząt, różnymi rodzajami Fimucutes, po których pojawiają się Bacterioidetes, postanowiono zbadać, czy ten rozwój można doświadczalnie zmienić. Kurczęta zaszczepiono doustnie mikroflorą ślepego jelita w wieku 1-, 3-, 16-, 28- i 42-tygodni, określając u nich po 7 dniach, skład mikroflory. Zaszczepienie tymi samymi bakteriami, obecnymi u kurcząt-dawców, decydowało o składzie microbiota jelita ślepego kurcząt biorców, zaszczepionych wyciągiem z jelita ślepego, pochodzącego od różnych dawców, utworzonych z oddzielnych grup (Varmuzova i in., 2016).

Mikrobiota chronią przed Salmonellą Enteritidis?

Varmuzova i in., (2016) określili ochronne działanie mikroflory kątnicy, u 1-, 3-, 16-, 28- i 42-tygodniowych kur przed S. Eteretidis. Po zakażeniu ptaków tą bakterią ich liczba w jelicie ślepym była znacząco wyższa u nieskolonizowanych, ale zaszczepionych kurcząt mikrobiotą, pochodzącą od 1-tygodniowych dawców, niż u kurcząt zaszczepionych jelitową mikroflorą, pochodzącą od 3-tygodniowych lub starszych kurcząt. Podobne wyniki stwierdzano również w przypadku zasiedlenia wątroby. Zaszczepienie mikroflorą kału, pochodzącą od 3-tygodniowych lub starszych kurcząt, znacznie zwiększa ich odporność na zakażenie Salmonellą (Rychlik, 2018).

Lecznicze zastosowanie mikrobiota w zwalczaniu Salmonella Enteretidis

Nowo wyklute kurczęta, zaszczepione przez Varmuzovą i in.(2016) mikroflorą, zakażono 24 godziny później Salmonellą Enteretidis lub podając im równocześnie mikrobiom zakażano bakteriami S. Enteretidis. Mikrobiota podawano równocześnie lub powtórnie, nie chronił kurcząt przed zakażeniem bakteriami Salmonella Enteretidis, natomiast kurczęta, zaszczepione mikrobiomem przed zakażeniem tą bakterią, były skutecznie przed nią chronione.

Leczenie antybiotykami w zależności od składu mikrobiota

Aby rozpoznać reakcję kałowego mikrobiotu kurcząt na stosowaną tetracyklinę lub streptomycynę, Videnska
i in. (2013), zsekwencjonowali regiony V3/V4 genu 16S rRNA. Dwa dni po terapeutycznym zastosowanie obu antybiotyków, oszacowano całkowitą liczbę 4592 OTU (Operacyjna Jednostka Taksonomiczna) w kale przed leczeniem, stwierdzając zmniejszenie ich liczebności. Przerwanie antybiotykowej terapii na 12 dni, umożliwiło szybką odnowę mikroflory, odpowiednio do 1675 i 1800 OTU po leczeniu streptomycyną i tetracykliną. Ponowne podawanie antybiotyku, uprościło skład mikrobiomu, po wielokrotnych terapiach jednym lub drugim antybiotykiem.

Analiza niższych poziomów taksonomicznych wykazała, że zastosowanie obu antybiotyków, zmniejszyła częstość występowania Bifidobacteriales, Bacteroidales, Clostridiales, Desulfovibrionales, BurkholderialesCampylobacteriales. Z drugiej strony, liczebność bakterii rzędu EnterobacterialesLactobacillales wzrosła po podaniu tetracykliny i streptomycyny.

Analizowano skład rzędów bakterii, których obecność towarzyszyła większej zachorowalności. Escherichia obejmowała ok. 98% wszystkich Enterobacteriales, przy czym wzrost liczebności obserwowano dla całego rzędu Escherichia, po podaniu streptomycyny lub tetracykliny. Rząd Lactobacillales obejmuje 10 różnych rodzajów, z których rodzaje Lactobacillus, Enterococcus, Paralactobacillus i Streptococcus tworzyły ponad 99% wszystkich Lactobacillales. Jednak tylko bakterie rodzaju Enterococcus, zwiększyły swą liczebność po zastosowaniu terapii obydwoma antybiotykami.

Wpływ mikroorganizmów przewodu pokarmowego na główne metaboliczne szlaki

Firmicutes, zasiedlające jelito ślepe, miały Fe2+ pozyskane z przemiany lipidów. Główni producenci maślanu to Anaerotruncus, Faecalibacterium, Megasphaera, SubdoligranulumButyrivibrio posiadające acetylotransferazę i jeden z dwóch dodatkowych enzymów, niezbędnych do wytwarzania maślanu, tj. hydratazy 3-hydroksyacylo-CoA lub hydratazy enoilo-CoA (Polansky i in., 2016).
Bacteroidetes uczestniczą w przemianie lipidów, zależnej od acylowych białek nośnikowych, w cyklu pentozowym i wymianie tlenowej fumaranu. Z niektórych, rzadko występujących białek, Parabacteoides charakteryzują się 3’-fosfoadenozyną 5’-fosfosiarczanu sulfotrasferazy, a Bacteroides – z adenylotransferazą siarczanową, uczestniczą w przyswajaniu siarczanu. Bakterie Alistipes posiadają dekarboksylazę glutaminianową, metabolizującą kwas glutaminianowy na γ-aminomasłowy (GABA). Do produkcji propionianu, bakterie Alistipes, Bacteroides, Parabacteroides, Paraprevotella, PrevotellaTannerella, wykorzystywały wiążącą kobalaminę – mutazę metylmalonylo-CoA i/lub epimerazę metylomanonylo-CoA. Bakterie szczepu Bacteroidetes, poddane ekspansji enzymatycznej w polisacharydowej degradacji alfa-amylazy, alfa-1-2-mannozydazy, endo-1,2-β-mannozydazy lub rozgałęzionej alfa-1,6-glukozydazy glikogenowej, ulegały specyficznemu uzewnętrznianiu się. Bacteroides, Alistipes, Paraprevotella Tannerella charakteryzowały się wysoką ekspresją izomerazy ksylozy, a Bacteroides – cukrozą-6-fosfato-hydrolazą, alfa-L-fukoidazą, alfa-glukoidazą, hydrolazą glikozylową i D-arabinozą 5-izomeraż fosfatu (Polansky i in., 2016).

Reakcja kur na zasiedlenie mikroorganizmami ich przewodu pokarmowego

Badania przeprowadzono na 7-dniowych kurczętach, przy użyciu spektrometru masowego, wykorzystując białka ściany jelita ślepego (Volf i in., 2016). Kurczęta grupy kontrolnej, zaszczepiono w 1-dniu życia wyciągiem z jelita ślepego, uzyskanym od 4 lub 40-tygodniowych kur-dawców. Mikroflora jelita pobudzała ekspresję ISG12-2, homologu białka ES1, syntetazę 2’-5’-oligoadenylanową, region stały immunoglobuliny IgM, lekki łańcuch gamma immunoglobuliny, dezaminazę cytrynianową, białko MPR-126, białko usunięte ze złośliwego guza mózgu, białko związane z angiopoetyną 6, hemopeksynę, NK-lizynę, homolog rybonukleazy RSFR, lizozym G-podobny 2, awidynę, CUB i białko warstwy 1 z osłonką strefową i reduktazę aldozową. Z drugiej strony, zaszczepienie kurcząt-biorców jelitową mikroflorą powodowało u nich obniżenie poziomu aldolazy B fruktozo-bisfosforanowej, transthyretyny, kalbidyny D28, retinaldehydrogenazy 1, dehydrogenazy alkoholowej 1C, aldo-ketoreduktazy 1-podobnej do B1 i estradiolu-17-β-dehydrogenazy 2.

Wnioski

Rozwój mikroflory wg określonego wzoru u wyklutych kurcząt, można łatwo modyfikować od pierwszego dnia ich życia. Kurczęta reagują na zasiedlenie mikroflorą przewodu pokarmowego, a kolonizacja mikroflorą ich jelit, zwiększa ich odporność na zakażenie Salmonellą. Komórki tkanek kurcząt, reagują na kolonizację mikroorganizmami jelita ślepego, modyfikacją wielu białek. Można określić istotne metaboliczne szlaki i biologiczne procesy zachodzące w poszczególnych składnikach mikrobioty, co umożliwia przewidywanie roli całych populacji drobnoustrojów w zdrowym organizmie. Można też hodować kultury beztlenowców jelitowych i tworzyć ich struktury o określony składzie, działające w przypadku braku kontaktu między kurą-matką a kurczętami.