Dr inż. Ryszard Gilewski
Prof. dr hab. Stanisław Wężyk

Epigenetyka

Wstęp

W po-genomowej epoce, epigenetyka stała się nauką, badających dziedziczne cechy organizmu, wprowadzane biochemicznymi modyfikacjami sekwencji DNA lub histonów, warunkujących zmienną ekspresję genetycznego materiału. Sekwencjonowanie DNA polega na odczytywaniu w nim, kolejności nukleotydowych par (sekwencji), przy pomocy zautomatyzowanych sekwencjonatorów lub ręcznie – opracowując nowatorskie metody. Histony są zasadowymi białkami wchodzącymi w skład chromatyny, neutralizującymi i wiążącymi kwas deoksyrybonukleinowy (DNA). Mają niewielką masę cząsteczkową (<23 kDa) i charakteryzują się dużą zawartością zasadowych aminokwasów, zwłaszcza lizyny i argininy, wiążąc się z helisą DNA, tworzą nukleoproteiny. Na epigenetyczne mechanizmy regulujące metylację DNA, modyfikację histonów i niekodującego RNA, wpływają czynniki środowiska. Hodowca lub producent drobiu, by zrozumieć znaczenie epigenetyki w mechanizmach dziedziczenia, musi poznać sposoby, w jaki ona wpływa ona rozwój, zdrowie i cechy produkcyjne drobiu. Metylacja DNA jest procesem przyłączania grup alkilowych metylowych) do zasad azotowych nukleotydów, w szczególności do cytozyny, rzadziej do adeniny. Epigenetykę można też określić jako naukę o fenotypowych zmianach osobnika, spowodowanych innymi mechanizmami niż sekwencje DNA. Odkrycie modyfikacji histonów i ich potencjalnego wpływu na regulowanie transkrypcji dowodzi, że zależy ona nie tylko od genów i sekwencji DNA. Transkrypcja jest procesem syntezy RNA na matrycy DNA, dokonywanej przez różne jego polimerazy, czyli jest rzepisywaniem/powielaniem informacji zawartej w DNA – na RNA. Metylacja DNA polega na przyłączaniu alkilowych grup (metylowych) do azotowych zasad nukleotydów, a szczególnie do cytozyny, rzadziej do adeniny. Epigenetyczne mechanizmy są związane z wieloma, ważnymi biologicznymi procesami. Nowe metody sekwencjonowania/dzielenia, zrewolucjonizowały badawcze metody określenia w całym genomie, zmodyfikowanych profili histonów i metylowanego DNA. Epigenetyka między innymi dotyczy regulatorów łączących wpływ genotypu z różnymi czynnikami środowiska, warunkującymi występowanie chorób u osobników spokrewnionych. Kluczem do morfologicznego i funkcjonalnego zróżnicowania komórek w obrębie organizmu, jest ustalenie specyficznych wzorców ekspresji genów. W genomie kury wg. Sławińskiej i Siwek (2010), jest 38 chromosomów autosomalnych oraz 2 chromosomy płci, które są określane literami W i Z, przy czym płeć żeńska jest heterogametyczna (ZW), a męska – homogametyczna (ZZ). Genom kury składa się z ok. 1,05 miliarda nukleotydów, o molekularnej masie 1,25 pg haploidalnego zestawu chromosomów i 20 000-23 000 genów, przy czym w każdej komórce, tylko część z nich ujawnia ekspresję. Na specyficzne wzorce ekspresji, wpływają epigenetyczne modyfikacje, obejmujące: metylowanie DNA, modyfikacje histonów i struktury chromaty­ny, a także funkcje niekodującego RNA. Kowalencyjne zmiany histonów i procesy metylowania DNA są współzależnymi zjawiskami, które mogą się wzajemnie pobudzać. Modyfikacje białek chromatyny, regulowane są swoistymi enzymami oraz białkowymi kinazami, fosfatazą, enzymami związanymi z ubikwityną i białkiem SUMO oraz tzw. koaktywatorowymi białkami. Ich działanie decyduje o tzw. „histonowym kodzie, który w połączeniu z białkami związanymi z chromatyną, determinuje wzór ekspresji genowej, w odpowiedzi na zewnętrzne czynniki. Epigenetyczne reakcje mają związek z takimi neurologicznymi chorobami jak: choroba Huntingtona, choroba Parkinsona czy choro­ba Alzheimera. Ubikwityna jest małocząsteczkowym białkiem obecnym we wszystkich komórkach eukariotycznych, pełniącym kluczową rolę w naznaczaniu białek (ubikwitynacja), które mają ulec zniszczeniu. Białko SUMO, steruje chemicznymi procesami, które osłabiają lub wzmacniają mechanizmy ochronne komórek nerwowych mózgu. SUMO są rodziną małych białek, generują reakcje aktywności mózgu, co umożliwia regulację informacji przekazywanych przez receptory kwasu kainowego, obsługujące całą komunikację między komórkami nerwowymi, a ich podrażnienie może doprowadzić do epileptycznego ataku i śmierci nerwowych komórek. Udział metylowanego DNA w różnych regulacyjnych funkcjach, potwierdza znaczenie epigenetycznych mechanizmów w kontroli transkrypcji. Epigenetyka opisuje zatem zjawiska, dzięki którym w identycznych genetycznie komórkach lub organizmach, dochodzi do różnych sposobów ekspresji genów, skutkujących zróżnicowaniem fenotypów. Nie wyjaśniono wszystkich, różniących się mechanizmów epigenetyki, które są interesującymi i nierozwiązanymi, problemami współczesnej biologii. Stabilne, odziedziczalne, wyciszanie ekspresji genów, ma związek z chemicznymi modyfikacjami białek histonowych i DNA.

Epigenetyka a rozwój drobiarstwa

Kura była jednym z pierwszych zwierzęcych modeli w epigenetycznych badaniach, a zwłaszcza metylowania DNA. Geny determinują ekspresję albuminy i konalbuminy w jajowodzie oraz w procesach trawienia, w obecności różnych metylowanych i niemetylowanych enzymów. Przecinają one nić DNA w miejscu wyznaczanym specyficzną jego sekwencją o symetrycznym charakterze i o długości 4 – 8 par zasad. Restryktazy wraz z metylazami DNA, stanowią system restrykcji i modyfikacji DNA, który w prokariotycznych organizmach jest obronnym mechanizmem, zapobiegającym włączeniu DNA bakteriofaga, do genomu bakterii. Endonukleazy są enzymami należącymi do klasy hydrolaz, które działając na DNA i RNA, rozkładają je do oligonukleotydów, przez rozerwanie wiązań fosfodiestrowych wewnątrz łańcucha kwasu nukleinowego. Globuliny będące frakcją białek osocza krwi, są odpowiedzialne za mechanizmy odpornościowe oraz wiążą tłuszcze i glukozę. Znajdują się w komórkach i tkankach wszystkich organizmów, wchodząc w skład ich cytoplazmy. U roślin gromadzą się w nasionach, a u zwierząt – w ustrojowych płynach, takich jak osocze krwi. Dobrze rozpuszczają się w roztworach soli, a nie rozpuszczają się w czystej wodzie. U kury, w określonych miejscach metylacji α-globiny, odkryto w zarodkowych erytrocytach i u dorosłych osobników oraz w komórkach mózgowych i plemnikach – leżące koło siebie geny DNA (klaster) i kodująjących blisko spokrewnione białka. Aktywność metylotransferazy DNA jest słabsza w mejotycznych komórkach, zawierających niemetylowany DNA, niż w niedojrzałych jądrach, ale zwiększa się w spermatogoniach o wyższym udziale metylowanego DNA. Regiony o różnej metylacji, mogą być związane z ekspresją genu we wczesnym okresie zarodkowego rozwoju, a niektóre epigenetyczne różnice między ssakami i ptakami, mogły się zachować w ewolucyjnym procesie. W pozarodkowym stadium kury, poziom metylowania DNA zmniejsza się z wiekiem. Długotrwałymi skutkami białkowego niedożywienia w okresie zarodkowym, są długotrwałe zmiany transkryptomu (wszystkich mRNA obecnych w danym momencie w komórce) wątroby oraz w patogenezie jej stłuszczenia kury. Poziom żywienia i rasa kury, wpływają na metylowanie genu UCP3 w piersiowym mięśniu. Wzorce metylowania DNA, były bardzo konserwatywne w regionie promotora u dzikich i domowych ras kur, wskazując ogólną ochronę tego procesu w całym genomie lub określonym miejscu tkanki mięśniowej. Gen CEBPA determinuje tworzenie białka zwanego CCAAT, które jest czynnikiem transkrypcyjnym, tzn., że łączy (wiąże) się z określonymi regionami DNA i pomaga kontrolować aktywność (ekspresję) określonych genów, a wiążąc białko α – wpływa na różnicowanie się niektórych krwinek. Gen PPAR gamma (Peroxisome proliferator-activated receptors), należy do grupy powszechnej w komórkach, w steroidowych receptorach jądrowych, kodujących aktywowane receptory proliferatami peroksysomów i odgrywających rolę w patologii takich chorób jak otyłość, cukrzyca, miażdżyca i rak. Pełnią one rolę czynników transkrypcyjnych, regulujących ekspresję wielu genów związanych z przemianą węglowodanów, tłuszczów i białek oraz z proliferacją różnych komórek i przebiegiem stanów zapalnych. Metylowane w specyficznych miejscach histony, odgrywają ważną rolę w regulacji genów.

Metylowanie DNA, a zdrowie drobiu

Badania z dziedziny epigenetyki początkowo były związane z mięsakiem opryszczki, a zwłaszcza z chorobą Mareka (MD), wywoływaną przez jej wirus (MDV) i opisaną jako chłoniak komórek T. MDV ma charakter nowotworowy i jest bardzo zaraźliwa, a komórki są związane z α-herpeswirusem. Choroba wyróżnia się naciekiem jednojądrzastych komórek obwodowych nerwów, gonad, tęczówki, wnętrzności, mięśni i skóry. Przez długi czas uważano, że odporność na MD i na ryzyko wystąpienia tej choroby wpływają czynniki genetyczne i środowiskowe oraz ich kombinacja. Argumentem przemawiającym za stosowaniem profilaktycznych szczepień, jest genetyczna odporność gospodarza na MD. Skuteczna kontrola MD, wymaga lepszego poznania mechanizmów interakcji gospodarz – wirusy. By wyjaśnić mechanizmy oporności na MD, badania koncentrują się na genetycznych różnicach między odpornością a wrażliwością kur na tę chorobę. He i in. (2016), we wsobnych, zbliżonych epigenomicznie liniach kur, zastosowali nowe metody sekwencjonowania, kombinowane metody metylowana DNA i histonów, niekodujące RNA (mikroRNA i lincRNAs) oraz statystykę i matematykę, by zidentyfikować mechanizmy, wywołujące nowotworowe choroby. Okazało się, że linia 63 jest stosunkowo odporna na nowotwory MD, ale podatna na wirus MDV, a linia 72 – jest wrażliwa zarówno MDV i guz MD. Podobne do siebie genetycznie wsobne linie, są unikalnymi modelami do badań epigenetycznych, umożliwiając zbadanie mechanizmów odporności i podatności na nowotworowe choroby. By szybciej poznać funkcjonalne wzorce odporności lub podatności na MD, poszerzono badania nad genami determinującymi odporność na tę chorobę i stwierdzono zmienny poziom ich ekspresji. Wykazano heterogenność metylacji DNA między kurami odpornymi i wrażliwymi na MD. Wywołanie przez MDV, dynamicznej zmiany ekspresji metylotransferazy DNA, zróżnicowało metylację między odpornymi, a wrażliwymi kurami na MDV. Aby dokładnie ustalić w obu liniach kur zmienność metylacji, wywołaną zakażeniem MDV, w całym genomie, każdej linii – zmapowano DNA i profile metylacji. Okazało się, że obniżono poziom metylacji u kur z opornej linii, zakażonej wirusem MDV oraz zidentyfikowano 11.512 różnych zakażonych regionów o zróżnicowanej metylacji. Poziomy metylacji in vitro były związane z replikacją MDV, a rozprzestrzenianie się MDV w zakażonych komórkach, było farmakologiczne hamowane metylacją DNA. Zmiany w metylacji DNA gospodarza, mogą być związane z jego odpornością lub podatnością na chorobę. Różnice metylacji wywołane wirusowym zakażeniem, mogą w konsekwencji spowodować zmianę transkryptomu gospodarza i prowadzić do różnych chorobowych objawów. Różne poziomy metylacji DNA, wywołane przez MDV w różnych liniach kur sugerują, że mogą one odgrywać rolę w kształtowaniu się odporności lub podatności gospodarza na MD.

Modyfikacje histonów, a zdrowie drobiu

Wykazano, że u odpornych i wrażliwych na MD kur, kilka kandydujących genów, o różnych poziomach metylacji DNA, może epigenetycznie wywoływać różną częstotliwość występowania nowotworów. W dwóch unikalnych liniach kur odpornych i wrażliwych na MD, niewiele jednak wiadomo o wzorcach modyfikacji histonów i żeby lepiej poznać ich funkcję, przeprowadzono ich analizę, przed i po zakażeniu MDV. Duża liczba specyficznych modyfikacji w liniach kur, wpływa na geny determinujące immunologiczną reakcję i adhezję komórek.

Niekodujące RNA, a zdrowie drobiu

Poza statycznymi modyfikacjami, badano równoczesne, szczególne właściwości chromatyny wywołane przez MDV podczas wczesnej cytolitycznej i utajonej fazy zakażenia torebki Fabrycjusza. Wykazało wyraźną zgodność między ekspresją genów, a znakami chromatyny, wskazując na przypuszczalną, epigenetyczną regulację reakcji na zakażenie MDV. Kompleksowa analiza szczególnych właściwości chromatyny, ujawniła dalsze wskazówki nt. efektów epigenetycznych zakażenia MDV. Limfocyty są białymi komórkami krwi, które pomagają organizmowi zwalczać infekcje. Powstają one w szpiku, śledzionie, w węzłach chłonnych i krążą we krwi oraz w naczyniach chłonnych, rozpoznając obce komórki, szybko dążą do ich zniszczenia. Rozróżniamy dwa typy limfocytów: limfocyty B i limfocyty T. Na podstawie modelu kury, opracowano dokładne identyfikowanie i określanie długich, niekodujących RNA (lincRNAs) i ich roli w genezie nowotworowych komórek T. Zidentyfikowano ponad 100O loci lincRNAs w torebce Fabriciusa kury. Analiza komputerowa wykazała, że lincRNAs występują u różnych gatunków, takich jak człowiek, mysz oraz kura i mają prawdopodobnie istotny związek z biologicznymi funkcjami, w tym z reakcją odpornościową. Zaobserwowano wyraźne różnice ekspresji lincRNA w torebce Fabryciusa między liniami kur odpornymi i podatnymi na MD. Wyniki badań He i in. (2016) potwierdzają znaczący wpływ lincRNAs na indukowanie nowotworowych komórek T i stanowią bogate źródło informacji opartych o funkcjonalne mechanizmy, stanowiące podstawę wrażliwości na tworzący się nowotwór.

Przyszłość epigenetyki drobiu

Epigenetyka jest aktywnym i ekscytujący obszarem badań, dostarczającym ogromną ilość nowych informacji, generowanych nowoczesnymi metodami sekwencjonowania. Współczesna epigenetyka proponuje największe możliwości, które mogą być wykorzystane dla poznania rozwoju organizmu ptaków, poprawy stanu ich zdrowia, poziomu dobrostanu i produkcyjności drobiu. Mimo, że nie odkryto działania tych mechanizmów, będą one identyfikowane jako unikalne, epigenetyczne czynniki, które mogą być wykorzystane jako epigenetyczne biomarkery. Wiedza o interakcji gospodarz-patogen zapewni lepsze zrozumienie epigenetycznych zmian, które można wykorzystać do określenie ich roli w kształtowaniu się stanu zdrowia i produkcyjności drobiu. Udoskonalone, epigenetyczne strategie, będą stosowane w zapobieganiu chorobom i w bardziej ukierunkowanej i skutecznej genomowej lub wspomaganej markerami selekcji, w programach hodowli drobiu. Autorom nie udało się w artykule pominąć i szeregu nowych pojęć i związanego z nimi – słownictwa. Należy zdać sobie sprawę, że na gwałtowny, w ostatnich 50 latach rozwój hodowli i produkcji drobiu – miał zasadniczy wpływ postęp osiągnięty w szeroko pojętej genetyce. Drobiarstwo przestało być uboczną, „zapyziałą”, przyzagrodową działalnością rolnika, od którego teraz wymaga się odpowiedniej wiedzy z wielu różnych dziedzin, w tym także z zakresu – epigenetyki.